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石正丽新研究:需持续监控蝙蝠(2)
研究团队研究了中华菊头蝠ACE2基因的多态性,并通过分子进化分析,蛋白质亲和力测定和病毒感染测定相结合,评估了它们对不同蝙蝠SARS相关冠状病毒刺突蛋白的敏感性和结合亲和力。
结果表明,SARS相关冠状病毒的刺突蛋白多样性可能会受到中华菊头蝠ACE2变体的自然选择压力; 在长期共存期间,SARSr-CoV刺突蛋白可能会被中华菊头蝠的ACE2选择,以维持自身遗传多样性并适合中华菊头蝠的种群。
ACE2基因在中华菊头蝠种群中表现出高度多态性
根据蝙蝠SARS相关冠状病毒的流行情况以及样品组织的可用性和质量,研究者使用来自三个省(湖北,广东和云南)的样品进行ACE2扩增。
除了团队先前测序过的蝙蝠ACE2(分别从湖北,广西和云南收集的样本ID 832、411和3357)和其他蝙蝠ACE2(GenBank登记号ACT66275,这是从香港收集的样本)外,研究者从21只中华菊头蝠蝠个体中获得了ACE2基因序列:湖北有5个,广东有9个,云南有7个。这些蝙蝠ACE2序列在其物种内显示98-100%的氨基酸同一性,与人ACE2的显示80-81%的氨基酸同一性。
这些蝙蝠ACE2在N端区域观察到了主要变化,包括一些先前已确定与SARS病毒的 S-RBD接触的残基。根据非同义SNP分析鉴定出8个残基,包括24、27、31、34、35、38。41和42。这8个残基的组合产生了8个等位基因,包括RIESEDYK,LIEFENYQ,RTESENYQ,RIKSEDYQ,QIKSEDYQ, RMTSEDYQ,EMKT KDHQ和EIKT EIKTKDHQ,分别命名为等位基因1-8。
除了先前研究(等位基因4、7和8)中的ACE2基因型数据外,研究者在中华菊头蝠种群中还鉴定出5个新的等位基因。“等位基因2”在两个省的样本中有发现,“等位基因4”在3个省中有发现,而其他等位基因似乎在地理上受到限制。总之,在广东发现了3个等位基因(4、6和8),云南发现了4个等位基因(1、2、4和7),在湖北发现了3个等位基因(2、4和5),在广西和香港分别找到了1个等位基因。在发现SARS病毒直接祖先的云南一蝙蝠洞中,研究者发现了4个等位基因共存。
综上所述,这些数据表明ACE2变异体已经在不同地区的中华菊头蝠种群中长期存在。与SARS病毒的S-RBD直接接触的位点的取代,表明它们在SARS病毒的进化和传播过程中可能具有重要功能。
中华菊头蝠ACE2变体对SARS相关冠状病毒感染表现出的不同敏感性
为了评估不同的中华菊头蝠ACE2分子是否会影响SARS病毒和蝙蝠SARS相关冠状病毒的进入,研究者在HeLa细胞中瞬时表达了中华菊头蝠的ACE2的变体,并测试了携带不同刺突蛋白的SARS病毒伪型或蝙蝠SARS相关冠状病毒的进入效率。
4株蝙蝠SARS相关冠状病毒按照S1序列可分为4个基因型。简单地说,与SARS病毒的刺突蛋白相比,SARS相关病毒RsWIV1的RBD与SARS病毒具有氨基酸高度同一性;RsWIV16是SARS病毒的近亲,在NTD和RBD均表现氨基酸高相似;Rs4231在NTD上与SARS病毒有着高度的氨基酸相似度;而RsSHC014在NTD和RBD区域与SARS病毒均有差异。
与之前的研究结果类似:所有四株具有相同基因组背景但不同刺突蛋白的蝙蝠SARS相关冠状病毒毒株,都可以利用人类ACE2进行相似水平的复制。
然而,它们在如何利用中华菊头蝠ACE2方面存在一些差异。所有测试病毒都能有效利用等位基因1、2、4、5进入。具有相同RBD的RsWIV1和RsWIV16则不能使用来自广东的等位基因6(样本ID 1434)。具有相同RBD的Rs4231和RsSHC014不能分别使用来自云南和广东的等位基因7(样本ID 3357)和等位基因8(样本ID 1438)。SARS病毒BJ01与WIV1和WIV16的RBD有很高的相似性,能够在假型感染实验中使用与Rs4231和RsSHC014相同的蝙蝠ACE2等位基因。
这些结果表明,病毒进入细胞都受到刺突RBD和中华菊头蝠 ACE2变异体的影响。
蝙蝠ACE2残基突变会影响其与SARS相关冠状病毒RBD的结合亲和力
为进一步了解SARS病毒和SARS相关冠状病毒对ACE2使用能力不同,研究者表达了冠状病毒BJ01、RsWIV1、RsWIV1、RsSHC014的RBD,和3个中华菊头蝠的ACE2,分别是等位基因6(样本1434),等位基因7(样本3357)和等位基因2(样本5720)。
随后,研究者测试它们之间的亲和力。阳性对照为SARS病毒BJ01的RBD 与人ACE2,阴性对照为SARS病毒RsWIV1的RBD 与人DPP4。实时分析表明,基于平衡解离常数KD,不同RBD与ACE2的结合亲和力不同。
与病毒感染实验结果一致,发现1434ACE2(等位基因6)与RsSHC014和BJ01结合,而与RsWIV1的RBD不结合;研究还发现3357ACE2(等位基因7)与RsWIV1结合,但不与RsSHC014和BJ01的RBD结合;5720ACE2(等位基因2)被发现能结合所有测试的RBD。所有被测试的RBD都与人类或蝙蝠ACE2具有很高的结合亲和力。然而,与两种蝙蝠SARS相关冠状病毒的RBD相比,它对中华菊头蝠ACE2的结合亲和力较低。
这些结果表明,刺突RBD与ACE2的结合亲和力影响病毒的感染能力。
ARS相关冠状病毒RBDs与中华菊头蝠ACE2s相互作用的结构模型
4个蝙蝠SARS相关冠状病毒的刺突蛋白大小相同,与SARS-CoV的氨基酸同源性超过90%,表明这些蛋白具有228个相似的结构。在本研究中,他们使用中华菊头蝠ACE2 3357(等位基因7)构建了蝙蝠SARS相关冠状病毒RsSHC014 RBD的结构复杂模型,并用中华菊头蝠ACE2 1434(等位基因6)构建了蝙蝠SARS相关冠状病毒RsWIV1 RBD的结构复杂模型。
这与SARS-CoV RBD与人类ACE2的结合亲和实验结果一致。与SARS-CoV RBD和人类ACE2界面的接触残基相比,可以观察到ACE2上的两个病毒病毒结合热点(hotspot hotspot Lys31和Lys353分别由Glu35和Asp38组成的盐桥)或附近的变化。如前所述,这两个热点隐藏在疏水环境中。它们为病毒-受体结合相互作用提供了大量的能量,并填补了结合界面上疏水性叠加238相互作用的关键空隙。
与人ACE2相比,中华菊头蝠ACE2-3357的两个主要残留变化是E35K和Y41H。E35K与RsSHC014 RBD中K31和Arg479的盐桥断裂,可能影响它们之间的结合亲和力。41位置的组氨酸可能会削弱K353- d38盐桥的支撑力,因为组氨酸比酪氨酸的疏水性更弱,导致其与BJ01 RBD的结合亲和力降低。因此,BJ01和RsSHC014 RBD与中华菊头蝠ACE2 -3357的结合亲和力较低。
在中华菊头蝠ACE2-1434中,位置31发现了苏氨酸,这与人类ACE2的这个位置不同,人类的是赖氨酸。虽然K31T的变化导致其不能与Glu35形成盐桥,但BJ01的RBD c中的Tyr442可以与之形成氢键。但RsWIV1 RBD中位于442的丝氨酸则不具备这种功能。
此外,RsSHC014含有一个位于479的精氨酸,Thr31不能与Glu35形成盐桥,使Glu35可以与Arg479形成盐桥,但RsWIV1中的RBD残基Asn479可能会导致其失去这一能力。因此,BJ01和RsSHC014 RBD可以与中华菊头蝠ACE2 -1434结合,但RsWIV1RBD无法与中华菊头蝠的ACE2 -1434结合。
本研究中所有的中华菊头蝠 ACE2在82的位置都包含一个天冬酰胺,而人类ACE2在此位置则是蛋氨酸。M82N的变化引入了一个不利的亲水残基,削弱了热点31周围的疏水网络。此外,Asn82引入了一个糖基化位点,就像在大鼠ACE2中一样,导致其不能有效支持SARS-CoV感染;ACE2在82位置上的聚糖可能导致空间干扰病毒RBD结合。
因此,M82N可能对SARS-CoV及SARS相关冠状病毒RBD与中华菊头蝠ACE2s的相互作用有显著影响。如前所述,RBD的487残基与ACE2上的热点353相互作用。RsWIV1 RBD中含有Asn487, Asn487的极性侧链可能与ACE2中Lys353残基的脂肪族部分发生不利的相互作用,影响K353与D38的热点相互作用。
此外,RsSHC014 RBD在位置487含有一个丙氨酸;Ala 487的小侧链不支持热点353的结构。因此,RsWIV1及RsSHC014 RBD与人类ACE2的结合亲和力均低于BJ01,但与人类ACE2的结合亲和力均高于中华菊头蝠ACE2,这与病毒感染和结合实验结果高度相符。
ARSr-CoV刺突基因通过正向选择与中华菊头蝠ACE2共同进化
为了测试作用于SARS病毒刺突蛋白和中华菊头蝠ACE2基因可能存在的选择压力,他们使用PAML软件包的编码ml程序来分析单个密码子的非同义突变与同义突变的比值(dN/dS比值)。通过分析了完整的编码SARS相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列,并比对了来自中华菊头蝠样本的9个SARS相关冠状病毒刺突蛋白的基因序列。
研究发现模型允许密码子在正向选择(M2a和M8)下进化。在模型M8(初始种子值ω(dN / dS) = 1。6,密码子频率= F3X4), 20个密码子(p > 0。95)以dN / dS > 1的速率正向选择,根据晶体结构显示,298个密码子中有17个被发现位于RBD区域,面向受体ACE2。此外,在SARS-CoV刺突中出现的5个密码子(442、472、479、480和487),此前已被确定对人类ACE2的结合亲和力有显著影响。
接下来,他们通过比对本研究获得的以及从GenBank下载的25个中华菊头蝠ACE2基因序列,对中华菊头蝠ACE2基因进行分析。他们发现在模型M8中,12个密码子(2。3%,p > 0。95)以dN / dS > 1的速率进行正向选择,其中8个密码子(31、24、27、34、35、38、41、42)对应于人类ACE2的残留物,这些密码子直接参与人类SARS病毒刺突蛋白的接触。
他们还分析了中菊头蝠(R。 affinis)的ACE2基因,有报道称该基因偶尔也能结合SARS相关冠状病毒。利用本研究获得的23个来自中菊头蝠的ACE2基因序列比对,发现中菊头蝠ACE2在整个编码区不同个体间的保守性比中华菊头蝠ACE2更强,并且没有观察到明显的正向选择位点(数据未显示)。
此外,通过查询单核苷酸多态性(SNP)数据库,他们发现人类ACE2基因中的SNPs在整个编码区域随机产生。虽然在人类ACE2中发现了两个具有非同义突变(T27A和E35K)的SNP位点,但它们在全球人群中都显示出罕见的频率(频率分别为0。00001和0。00002)。这些结果表明,在蝙蝠SARS相关冠状病毒刺突蛋白与中华菊头蝠ACE2的交界面发生了正向选择。
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